ICS 65.150 CCS B 51 DB2102 大连市 地 方 标 准 DB2102/T 0083—2023 小新月菱形藻藻种提纯复壮技术规程 Code of practice for puri fication and rejuvenation of Nitzschia closterium 2023 - 06 - 07发布 2023 - 07 - 07实施 大连市市场监督管理局 发布 DB2102/T 0083—2023 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的 某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由大连市农业农村局提出。 本文件由大连市海洋发展局归口。 本文件起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院 本文件主要起草人：刘卫东、刘忠颖、鲍相渤、李云峰、李玉龙。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可通过来电、来函等方式进行反馈， 有关单位将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：大连市 海洋发展局（大连市西岗区长春路 186号），联系电话： 0411-62916679 。 文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁 50号），联系电话： 13384111868 。 DB2102/T 0083—2023 1 小新月菱形藻藻种提纯复壮技术规程 1 范围 本文件规定了水产养殖用小新月菱形藻 Nitzschia Closterium 藻种（以下简称藻种）提纯复壮的术语 和定义、 水质和设施设备条件 、藻种培养液和固体培养基的配制 、消毒除菌、固体培养基 藻种培养及保 存、细胞提纯复壮及扩繁 等内容。 本文件适用于水产养殖用小新月菱形藻 等低温硅藻的一级藻种提纯复壮。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 11607-1989 渔业水质标准 SC/T 2047 -2006 水产养殖用海洋微藻保种操作技术规范 DB21/T 2777 -2017 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 藻种细胞提纯复壮 purification and rejuvenation of algae cells 通过分离技术，将混杂或衰退藻种中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养以 恢复原藻种的典型性状。 3.2 固体培养基 solid medium 在培养液中加入适宜凝固剂，灭菌处理后凝固制成平板或斜面，用于微藻藻种的分离、 纯化、复壮、 保存培养的培养基。 3.3 藻种克隆 algae cloning 由同一个藻种细胞分裂繁殖而形成的 、具有相同遗传物质的细胞系。 DB2102/T 0083—2023 2 4 水质和设施设备条件 4.1 水质条件 所用海水应经沉淀、过滤处理，水质 应符合GB 11607-1989的规定。 4.2 设施设备 4.2.1 清洗设备 水槽、试管刷和大瓶刷 。 4.2.2 消毒设备 紫外灯、烘箱、高压灭菌锅、电陶炉、煤气或液化气灶具。 4.2.3 操作观察设备 显微镜、超净工作台、电子天平、 配制营养液所需化学试剂（分析纯及以上等级）、量程为 100μl 和1 ml移液器及配套枪头，用于培养的一次性无菌培养皿（直径 90 mm～100 mm）和20 ml～40 ml玻璃试 管（配有带砂芯乳胶塞），试管架、 20 ml一次性无菌注射器及 0.22μm孔径无菌针筒式滤膜过滤器。 4.2.4 培养保种设备 光照培养架、低温展示柜、恒温光照培养箱 。 5 藻种培养液和固体培养基的配制 5.1 营养液配制 5.1.1 康威培养基（以下简称 A液）、康威培养基 —微量元素溶液（以下简称 B液）和康威培养基 — 硅酸钠溶液 的成分参照 DB21/T 2777-2017附录A，康威营养液由 A液和B液组成，具体如下： a) 配制A液时，将 DB21/T 2777-2017表A.1.1中试剂加入纯水中，加热至试剂完全溶解； b) 配制B液时，将 DB21/T 2777-2017表A.1.2中试剂加入纯水中，滴加 10%盐酸摇匀，至试剂 完全溶解，液体澄清 ； c) 将B液全部倒入 A液中，放 置12 h以上，即成为康威营养液。 5.1.2 藻种培养用尿素溶液配方见附录 A。 5.2 固体培养基用抗生素溶液配制 藻种固体培养基用抗生素溶液配方见附录 B。 5.3 藻种扩繁用培养液配制 灭菌海水 冷却后，按照1000：1体积比分别 加入灭菌的康威营养液、康威培养基 —硅酸钠溶液和尿 素溶液后摇匀。 5.4 固体培养基配制 向100 ml海水中加入 0.8 g～1 g琼脂粉，加热至溶解 制成琼脂海水基质，高压灭菌后置超净工作台 中，于室温下冷却至 45℃～55℃时按照1000：1体积比分别添加灭菌的康威营养液、康威培养基 —硅酸 DB2102/T 0083—2023 3 钠溶液、尿素溶液和抗生素溶液后摇匀， 立即向一次性灭菌培养皿内倒入约 20 ml，使培养基铺满每个 培养皿底部，静止 放置至培养基凝固后，倒置于超净台中备用。 6 消毒除菌 6.1 藻种扩繁用海水灭菌 按照SC/T 2047-2006中5.1.1规定的微藻 分离、保存用海水的消毒方法 执行。 6.2 营养液和固体培养基灭菌 康威营养液、康威培养基 —硅酸钠溶液以及琼脂粉海水基质应采用 121 ℃高压蒸汽灭菌 15 min，尿 素溶液应采用 0.22μm孔径无菌针筒式滤 膜过滤器过滤除菌。 6.3 器具灭菌 塑料器具 应采用121℃高压蒸汽灭菌 15 min，灭菌后置于80℃恒温箱烘干；玻璃器具应用 135℃恒温 3 h灭菌。 7 固体培养上藻种培养与保存 7.1 接种 7.1.1 藻种活化 藻种（细胞浓度为 8×106 cell/ml～1.2×107 cell/ml）按照1：1000比例接种藻种扩繁用培养液， 环境温度 17℃～20℃，光照度3000 Lux～6000 Lux下培养2 d。 7.1.2 藻种的接种 用微量移液器向固 体培养基上添加 100μL灭菌海水，取活化藻种 10μL～20 μL放入固体培养基中 ， 使灭菌海水与藻种混合。 向固体培养基上加入 4颗～6颗直径4 mm左右的玻璃珠，盖好培养皿，水平摇晃培养皿， 使玻璃珠在 培养基上随机滚动， 将藻种和海水均匀涂布 在固体培养基上。 2 h～4 h后，固体培养基 上液体被基本吸 收后，用封口膜缠绕培养皿侧面，将培养皿上下结合部空 间封闭。 7.2 藻种克隆的培养 适宜条件下（见 7.1.1）培养固体 培养基上的藻种细胞， 25 d～30 d后，在固体培养基上长出 1 mm 以上的藻种克隆。 7.3 藻种克隆的度夏保种 当固体培 养基上长出大于 1 mm的藻种克隆时，应将培养皿放置于 4℃～6℃透光低温展示柜保存，保 存期可达 5个月～17个月。 8 细胞提纯复壮及扩繁 DB2102/T 0083—2023 4 8.1 固体培养基 上藻种细胞的提纯复壮 秋季，室 温下降至 20℃时，对固体培养基上 藻种细胞进行提纯复壮筛选： ——将固体培养基置于显微镜下观察各个藻种克隆，挑选细胞形状饱满、细胞数量多、色素均匀且 没有细菌混杂的藻种克隆 ； ——用灭菌牙签将选择好的藻种克隆挑起， 放入盛有 10 ml扩繁营养液的试管中， 于适宜条件下 （见 7.1.1）培养，同时进行多个藻种克隆的筛选培养，一个藻种克隆培养一管，不同藻种克隆间 不应相互混淆。 8.2 提纯复壮藻种的扩 繁 当试管内的藻细胞生长密度 超过3×106 cell/ml时，比较不同试管中克隆细胞的密度，挑选细胞密 度较大的克隆群体， 倒入盛有 400 ml扩繁营养液的 500 ml三角烧瓶中 , 适宜条件下 （见7.1.1）扩繁培养。 DB2102/T 0083—2023 5 A A 附 录 A （资料性） 藻种培养用尿素溶液配方 A.1 藻种培养用尿素溶液配方见表 A.1 表A.1 藻种培养用尿素溶液配方 成分 用量 尿素 3.0 g 蒸馏水 100 ml