ICS 65.150 B 50 DB11 北 京 市 地 方 标 准 DB11/T 1397—2017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 The technical protocol of screening oral antibacterials for fish 2017 - 03 - 22 发布 北京市质量技术监督局 2017 - 07 - 01 实施 发 布 DB11/T 1397—2017 前 言 本标准根据GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：王小亮、王静波、王姝、曹欢、张文、王澎、徐立蒲、那立海。 I DB11/T 1397—2017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 1 范围 本标准规定了鱼类口服抗菌药物选用原则、程序和操作流程。 本标准适用于养殖鱼类细菌感染判断和治疗时口服抗菌药物选用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27623.1—2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验 SC/T 7014—2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1—2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 药物选用原则和程序 3.1 原则 抗菌药物使用应遵循以下原则： ——药物种类应符合国家有关标准，药品应获得国家批准文号； ——选择 GMP 认证企业生产的抗菌药物； ——使用的优先顺序是磺胺类＞四环素类＞氨基糖苷类＞氟喹诺酮类＞酰胺醇类。 3.2 程序 鱼类口服抗菌药物的选用程序参见附录A。 4 操作流程 4.1 病鱼采集 病鱼采集按SC/T 7014—2006第6章的规定进行。 4.2 病原菌的分离 病原菌的分离参见附录B。附录B中的BHIA的培养基配方参见C.1。 4.3 细菌感染判断 任何一个划线分离平板，线上有菌落或菌带，则该样品来源养殖池塘的鱼类宜用口服抗菌药物；反 之，则不必使用。 1 DB11/T 1397—2017 4.4 敏感药物筛选 采取纸片扩散法（参见D.3）筛选敏感药物种类。依检测结果选择敏感药物种类，原则如下： ——一个样品仅获得一株病原菌，选择该菌的敏感药物种类； ——一个样品获得多株病原菌，选择共同的敏感药物种类； ——一个样品获得多株病原菌，且无共同的敏感药物种类，选择内脏器官分离菌的敏感药物种类， 优先选取肝、肾分离菌的敏感药物种类。 4.5 用药剂量确定 4.5.1 检测病原菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 采用浓度梯度稀释法（参见D.4）检测其对样品所有病原菌的MIC值。 4.5.2 计算样品每千克鱼的日用药剂量 按4.5.1检测样品所有病原菌的MIC值，同种药物选取最大的MIC值。每种敏感药物按公式（1）计算 样品每千克鱼的日用药剂量，每千克鱼的日用药剂量不超过国家兽药规定的使用许可值。 U = MIC ´ S ¸ r ..................................... (1) 式中： U ——每千克鱼的日药物使用剂量（指有效成分剂量），单位为毫克每千克（mg/kg）； MIC ——抗菌药物对病原菌的MIC值，单位为毫克每升（mg/L）； S ——系数，鲤科鱼类为8.1，冷水鱼类为9.4，养殖者可依经验微调该系数； r ——水的密度，数值约为1，单位为千克每升（kg/L）。 4.5.3 计算样品池塘的日药物总使用剂量 每种敏感药物按公式（2）计算样品池塘的日总用药剂量。 M = U ´ T ¸ 1000 .................................... (2) 式中： M ——样品池塘的日药物总使用剂量（指有效成分剂量），单位为克（g）； U ——每千克鱼的日药物使用剂量（指有效成分剂量），单位为毫克每千克（mg/kg）； T ——样品池塘养殖鱼类的总重量，单位为千克（kg）。 4.6 使用方法 将样品鱼来源池塘的饵料日投喂量减少一半。将4.5.3确定的日药物总使用剂量溶解拌入饵料中， 充分混匀，一次性投喂使用。 4.7 用药效果评价 用药后，按以下原则判断用药效果： ——如用药后 3 d～5 d，日死亡数量明显下降或疾病的症状改善甚至消失，则认定药物治疗有效； ——如用药后 3 d～5 d，鱼的日死亡数量保持治疗前的水平或者超过治疗前的水平，则认定药物 治疗无效。 2 DB11/T 1397—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 鱼类口服抗菌药物选用程序 发病池 治 疗 及 用 药 效 果 评 价 病原菌的分离 病鱼采集 平板线上是否有 菌落或菌带 否 病鱼不用抗菌药物 是 敏感药物筛选 使用方法 用药剂量确定 图A.1 鱼类口服抗菌药物选用程序示意 3 DB11/T 1397—2017 BB 附 录 B （资料性附录） 病原菌的分离 B.1 设备和材料 B.1.1 B.1.2 B.1.3 B.1.4 B.1.5 B.1.6 B.1.7 B.1.8 B.1.9 B.1.10 普通天平：0 g～210 g，精确至0.01 g。 高压灭菌锅。 微波炉。 生物安全柜或超净工作台。 生物显微镜：×10，×40，×100。 培养皿：直径90 mm。 酒精灯、解剖盘、解剖刀、剪子、镊子、接种环（针） 、三角烧瓶（500 mL）等。 试剂和培养基 水：GB/T 6682，二级。 脑心浸液琼脂（Brain Heart Infusion Agar, BHIA） ：参见C.1。 B.2 取样部位 病灶、肝、肾、脾、性腺、脑。 B.3 病原菌分离 B.3.1 冷水鱼病原菌分离 用接种环从取样部位蘸取病料，无菌操作划线接种于BHIA平板， 22 ℃±2 ℃培养24 h～48 h，无 菌生长时继续培养至5d。 B.3.2 温水鱼病原菌分离 用接种环从取样部位蘸取病料，无菌操作划线接种于BHIA平板，28 ℃±2 ℃培养24 h～48 h，无 菌生长时继续培养至5d。 4 DB11/T 1397—2017 CC 附 录 C （资料性附录） 培养基的配制方法 C.1 脑心浸液琼脂（BHIA） C.1.1 成分 牛脑浸粉 牛心浸粉 蛋白胨 葡萄糖 氯化钠 磷酸氢二钠 琼脂 蒸馏水 12.5 g 5.0 g 10.0 g 2.0 g 5.0 g 2.5 g 10 g 1000 mL C.1.2 制法 将C.1.1 中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.4±0.1，121 ℃高压灭菌20 min，冷至50 ℃左右， 倾制平板。 C.2 水解酪蛋白琼脂（MHA） C.2.1 成分 牛肉浸膏 酸水解酪蛋白胨 可溶性淀粉 琼脂 蒸馏水 6.0 g 17.5 g 1.5 g 17.0 g 1000 mL C.2.2 制法 将C.2.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.3±0.1，121 ℃高压灭菌15 min，冷至50 ℃左右，倾 制平板。平板中的培养基厚度4 mm。 C.3 水解酪蛋白肉汤（MHB） C.3.1 成分 牛肉浸膏 酸水解酪蛋白胨 可溶性淀粉 6.0 g 17.5 g 1.5 g 5 DB11/T 1397—2017 蒸馏水 1000 mL C.3.2 制法 将C.3.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.3±0.1，121 ℃高压灭菌15 min。如检测链球菌，临 用前加无菌血清0.5%。 6 DB11/T 1397—2017 DD 附 录 D （资料性附录） 病原菌的药物敏感性检测 D.1 设备和材料 D.1.1 D.1.2 D.1.3 D.1.4 D.1.5 D.1.6 D.1.7 D.1.8 D.1.9 D.1.10 D.1.11 D.1.12 恒温培养箱：0 ℃～60 ℃。 精密天平：精确至0.0001 g。 高压灭菌锅。 比浊仪。 生物安全柜或超净工作台。 生物显微镜：×10，×40，×100。 微量移液器：100 μL～1000 μL，10 μL～100 μL。 多通道移液器：50 μL～300 μL。 培养皿：直径90 mm。 试管、试管架：15 mm×150 mm，15 mm×100 mm。 微孔板（≥500 μL/孔） 。 一次性针头过滤器（≤0.22 μm） 、注射器（5 mL） 。 D.2 试剂和培养基 D.2.1 水：GB/T 6682，二级。 D.2.2 0.45%氯化钠缓冲液。 D.2.3 二甲基甲酰胺：分析纯。 D.2.4 氢氧化钠：分析纯。 D.2.5 75%酒精。 D.2.6 药敏纸片。-20℃保存，药物种类及其溶解试剂见表D.1。药敏纸片可从可靠的供应商采购或自 行制备。 D.2.7 抗菌药物标准品。抗菌药物种类参见表D.1，标准品由兽药管理部门指定单位提供。 D.2.8 水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton Agar, MHA） ：参见C.2。 D.2.9 水解酪蛋白肉汤（Mueller-Hinton Broth, MHB） ：参见C.3。 D.3 纸片扩散法 D.3.1 制备菌悬液 8 从培养16 h～24 h的BHIA斜面上挑取纯培养菌，用0.45%氯化钠缓冲液配制成1.0×10 CFU/mL～2.0 8 ×10 CFU/mL的菌悬液。 D.3.2 接种平板 制好的菌悬液应在15 min内使用。用微量移液器取100 μL到MHA平板上，灭菌玻璃涂布棒涂匀。 7 DB11/T 1397—2017 D.3.3 贴药敏纸片 用灭菌的镊子取药敏纸片贴到D.3.2接种好的MHA平板上，镊子轻按药敏纸片，使药敏纸片与培养基 紧密相贴。每个培养皿均匀贴四片，标记药物名称、菌株名称和培养时间等。于28 ℃±2 ℃(杀鲑气单 胞菌为22 ℃±2 ℃)孵育15 min。 D.3.4 测抑菌圈直径 将D.3.3孵育后的平板倒置于28 ℃±2 ℃(杀鲑气单胞菌为22 ℃±2 ℃)生化培养箱中，培养24 h ±2 h后，观察结果。用游标卡尺或直尺测量抑菌圈直径（mm）。 D.3.5 结果解释 按照表D.1的标准对抑菌圈大小作出解释，判断病原菌对抗菌药物敏感或耐药。 表D.1 鱼类病原菌的抑菌圈直径解释标准和相对应的最低抑菌浓度值（MIC） 药物种类 药 名 配制母液的溶剂 磺