ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35330—2017 玉属植物X病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Hosta virus X 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35330—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检 疫局、中国农业大学 本标准主要起草人：张永江、张燕平、方志鹏、辛言言、魏梅生、冯黎霞、沈建国、李桂芬、李曼 朱水芳 1 GB/T353302017 玉替属植物X病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了玉簪属植物X病毒（HostavirusX）的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带玉替属植物X病毒的植物及其产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2964植物病毒检测规范 SN/T3457 7：植物病毒分子生物学检测规范 3 玉属植物X病毒基本信息 学名：Hosta virusX。 缩写：HVX。 异名：玉属植物病毒X，玉属X病毒，玉簪X病毒，玉馨属（百合科）植物病毒。 分类地位：曲线病毒科（Fleriviridae），马铃薯X病毒属（Potervirus）。 玉属植物X病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 玉簪属植物X病毒的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据HVX与抗体之间的 特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和胶体金免疫试纸条检测； 有效组合，判断样品是否带有HVX。 5 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、制 冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪。 5.2用具 酶联板、可调移液器（2.5uL、10μL、20μL、100μL、200L、1000L）和可调移液器头，离心管、研 1 GB/T35330—2017 钵、微型磨杆等。 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 附录E。 6抽样和样品制备 6.1抽样 有病毒危害症状的植物材料单独抽样，HVX的危害症状描述参见附录A；无症状的种子、苗木及 其产品抽样方法按照SN/T2122中的规定执行。 6.2样品制备 样品制备参照SN/T2964和SN/T3457规定执行。具体如下： 种子样品制样：每份抽样中随机采集5组样品，每组1g进行后续检测。 一苗木及其切花等产品：有明显症状的，直接取症状部位1g单独制样，用于后续检测；无明显症 状的，可5株混合采样用于后续检测 7检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 把制备的样品上清液加入已包被HVX抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行 加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染HVX的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液 作为空白对照：其中阴性对照的种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品相一致。 具体操作见附录B。 7.2胶体金免疫层析试纸条检测 7.3 3RT-PCR检测 RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C。 7.4 实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D。如采用商品化一 步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 7.5RT-LAMP检测 RT-LAMP检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的 总RNA，反转录合成cDNA后进行LAMP检测，具体操作见附录E。如采用商品化一步法试剂盒，则 2 SAG